开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
干扰细胞的有丝分裂从而阻止细胞的增殖是目前肿瘤化疗的一个主要切入点细胞的有丝分裂可从干扰微管蛋白的功能、抑制有丝分裂激酶的活性和干扰有丝分裂驱动蛋白的功能三个方面进行阻断目前临床应用广泛的抗肿瘤药物如长春花碱类、紫杉烷类等就是微管蛋白活性抑制剂, 但是由于微管蛋白活性抑制剂除了对有丝分裂的微管有作用, 对神经元轴突微管也有亲合力, 引起神经毒性. 纺锤体驱动蛋白(kinesin spindle protein, KSP/Eg5)是一种在细胞的有丝分裂中起着关键性作用的分子马达蛋白, 是有丝分裂过程中二极纺锤体形成和维持所必需的. 抑制 KSP 的功能将导致纺锤体极缺损, 结果形成单极星体结构, 从而引起可逆转的有丝分裂停滞. 因而持续使用 KSP 抑制剂将导致编程性细胞死亡。
生物学研究发现, 已发现的细胞可渗透的小分子 KSP抑制剂没发现类似于微管活性抑制剂的神经毒性, 对其他驱动蛋白均无抑制作用。[4]
有研究者利用反向虚拟筛选将已知的药物和配体重定位到纺锤体驱动蛋白上。基于配体的反向虚拟筛选基于“Chemicalsimilarity principle”原理，认为相似的化合物具有相似的化学性质，甚至有着相似的作用靶标。因此将提问化合物与数据库中的化合物一一进行相似性匹配打分，相似性最高的化合物作用靶标即认为是提问化合物的潜在作用靶标。[5]该研究者构建了基于小分子相似性搜索结合分子对接的反向虚拟筛选方法，使用PDB数据库中具有结晶的小分子构建小分子指纹库，通过比较目的小分子与PDB 小分子数据库中分子之间分子指纹的相似性寻找可能的分子结合靶点，使用分子对接验证小分子与该靶点之间是否能够发生结合，从而判断是否能够重定位到该靶点，进而获得药物重定位信息。该实验将PDB 小分子配体KE9 重定位到纺锤体驱动蛋白上并进行分子对接，发现KE9对KSP可能有抑制作用。。KE9 研发代号为AZD9496，为阿斯利康Savi 等人在XBR基础上研发的新型口服雌激素受体负调节剂，在临床前实验表现出了较高的口服生物利用度，目前正处于雌激素受体阳性乳腺癌的临床一期研究[1].因此，KE9可能对同时表达纺锤体驱动蛋白和雌激素受体的癌细胞具有双靶点的抑制作用。
- 要解决的问题
- 在分子水平上验证AZD9496与纺锤体驱动蛋白结合稳定性
- 在细胞水平上验证雌激素下调剂AZD9496对纺锤体驱动蛋白是否有抑制作用，是否能够引起细胞形成单极纺锤体，引起有丝分裂停滞。
- 可行性分析
- 近年来，随着超算技术的不断增强以及分子模拟方法理论的迅速发展和广泛应用，同源模建、分子对接、分子动力学模拟、结合自由能计算以及量子力学计算等分子模拟方法已经成为研究蛋白质与配体相互作用机制及其动态过程的重要手段。分子模拟方法为从分子、甚至原子水平上研究生命现象及揭示其本质规律提供了很好的手段，并可为实验提供有力的理论指导。随着分子模拟的理论完善及技术的进步，分子模拟方法正越来越多地被用于蛋白质结构与功能的关系、蛋白质与配体的相互识别以及药物设计的研究工作当中。[3]因此，采用分子模拟验证AZD9496与纺锤体驱动蛋白结合稳定性可以为接下来的实验提供指导。
- 通过MTT实验方法初步测定该药物对不同细胞系细胞的作用，来确定药物作用靶点是否是KSP。利用流式细胞仪测定该药对肿瘤细胞周期及凋亡的影响，利用免疫荧光实验更直观体现出化合物对肿瘤细胞内微管的影响。
- 研究方法和内容
MTT实验：
使用标准MTT 实验对筛选得到的候选分子对于MCF-7，231，HepG2人肿瘤细胞的抗增殖活性进行测定。MTT 实验步骤如下“
1, 细胞复苏后使用胰蛋白酶消化，1000 rpm times; 5 min 离心收集，使用含10% 血清 的
DMEM 重悬细胞，在显微镜下计数并调整细胞浓度为3times;104 个/ ml，将细胞接种到96 孔
板中，每孔接种100 mu;l。
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