Pcsk9小分子抑制的设计与合成文献综述

1. PCSK9调节动脉粥样硬化的新靶点

前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisinkexin type 9,PCSK9),于2003年被加拿大学者Seidah在研究神经细胞凋亡时发现。就在PCSK9被发现的同一年，Abifadel及其同事首先报道了PCSK9基因的突变造成的家族性高胆固醇血症，由此拉开了PCSK9与胆固醇代谢研究的序幕。

PCSK9对胆固醇的主要调节作用在于促进低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDLR）的降解使得LDLR的数目减少，进而打破LDLR的循环使循环中低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高。此外，PCSK9的功能的变化不仅影响LDL-C水平，且与冠心病风险相关。

PCSK9主要富集于成熟的肝脏细胞，在小肠、肾脏与发育中的神经系统亦有少量分布。机制研究表明，肝细胞中PCSK9的过表达并不影响LDLR mRNA水平，PCSK9通过蛋白-蛋白相互作用与LDLR结合介导LDLR进入肝细胞降解，影响了LDL在肝细胞表面的清除过程，导致体液中LDL-C和总胆固醇水平的升高^[1]。因此PCSK9抑制剂理论上可以维持肝细胞表面LDLR数量和LDL的血浆清除率，达到降低血浆胆固醇的效果。有研究者发现在一些功能缺失型突变PCSK9基因健康携带者体内，血浆胆固醇含量低于正常值^[2]，表明了抑制PCSK9介导的LDLR降解作为降低胆固醇的新机制具有可行性和安全性。目前，PCSK9已经成为降脂药物研发领域最具潜力的新靶点。

2、PCSK9的分子结构

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/可辛型9（PCSK9）属于前蛋白转化酶（Proprotein Convertases）家族。由692个氨基酸残基组成，主要表达于肝脏、肾脏以及小肠。与其家族成员相似，PCSK9是一种分泌性丝氨酸蛋白酶，主要在内质网合成，首先形成一个75kDa的前体，其未成熟的前体包含一个N端信号肽序列、一个前结构域、一个催化结构域和一个富含半胱氨酸的C端结构域。随后在内质网中PCSK9第152位残基经历一次自动催化性裂解，形成一个14kDa的前结构域片段和一个包含催化结构域和C端结构域的57kDa成熟片段。裂解后的前结构域仍然以共价键结合在催化结构域上，与成熟片段形成一个复合体，并作为一个分子伴侣与成熟片段一起离开内质网转运到高尔基体中，在高尔基体经过乙酰化等一系列修饰后最终分泌到血液中^[4]。前结构域的的结合可能发挥着抑制蛋白酶催化活性的作用，是PCSK9正确折叠并离开内质网后会经历二次蛋白酶加工作用，从而释放前结构域，暴露酶活性。而离开内质网后的PCSK9没有经历这种二次加工过程。因此PCSK9是唯一没有蛋白质底物的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶^[4]。

1. PCSK9对LDLR的转录后调节

LDLR是清楚血循环中LDL的主要受体，PCSK9主要是通过介导肝脏LDLR的降解、减少LDLR的数量、降低肝脏对LDL-C的清除，来发挥其在维持血脂稳态中的作用。肝脏过表达PCSK9的小鼠LDLR的水平是显著降低的，而LDLR mRNA 表达并未减少，因此，PCSK9是通过一种转录后机制来降级LDLR的。

LDLR 分子由 5 个主要的结构域组成，首先是一个由7个富含半胱氨酸序列组成的配体结合区，即配体结合重复序列 R1-R7; 其次是一个EGF样前体同源结构域，包括3个EGF样重复序列( EGF-A、EGF-B 和 EGF-C) 和一个6片叶的beta;螺旋桨结构，beta;螺旋桨结构位于EGF-B和 EGF-C之间; 接着是一个O连接的糖结构域; 然后是一个跨膜结构域; 最后是一个胞质尾区，含有受体内化所必须的序列。在 pH 中性的 细胞外环境下，LDLR 的胞外域是一个展开的线性结 构，有利于配体结合序列与 LDL 的相互作用。而在酸 性环境下，配体结合重复序列 R4 和 R5 结合到 EGF 前体同源区的 beta; 螺旋桨结构上，形成一个发夹结构，使得LDLR 与 LDL 亲和力降低并将其释放。

LDL与LDLR的配体结合域结合后，通过网格蛋白小窝内化入细胞并进入内体。由于内体中pH 值降低，LDLR发生构象改变并释放与之结合的LDL，释放的LDL进入溶酶体被降解，而 LDLR则返回到细胞膜，形成一个连续的循环过程。在此过程中，PCSK9通过与 LDLR 的结合，促进LDLR从内体转运到溶酶体被降解，抑制其返回到细胞膜^【5】。

4.PCSK9抑制剂的研发进展

PCSK9自2003年发现后已成为治疗高血脂症和心血管疾病的一个有效治疗靶点，携带PCSK9功能缺失性突变的人群，LDL-水平显著降低，但并无任何异常的健康状况，提示通过药理学干预以抑制PCSK9可能是安全的。而且抑制PCSK9可以显著提高他汀类药物的降脂疗效，因此高脂血症患者联合使用他汀类和PCSK9抑制剂可能容易达到一个理想的血脂水平^[6]。

目前，众多的国际知名药物公司竞相投入到PCSK9抑制剂的研发中，包括单克隆抗体，寡核苷酸类，抑制多肽等大量分子实体在研或在临床研究阶段，其中，尤以单克隆抗体类抑制剂引人注目。Amgen研发的Evolocumab和Sanofi与Regeneron联合研发的Alirocumab在PCSK9单抗领域处于领先地位。在完成了一、二期临床后又相继公布了三期临床实验数据，结果显示在大样本量（4465/ 2341）的高胆固醇血症患者中，二者降低血液胆固醇含量平均达60%以上，疗效显著，均达到了主要疗效终点^[7]。据预期，两家公司的单抗最早有望在2015年下半年上市。

然而，这些在研PCSKC9的抑制剂均是生物类药物，存在固有的制剂缺陷如经皮下注射给药的单抗类药物有可能诱导机体产生抗药物抗体，从而降低药物疗效并增加副作用。单抗药物制备提纯过程复杂，因此价格高昂，加上皮下注射，使用不便，对患者的依从性有较高要求。另外，即使PCSK9单抗上市主要适用对象可能取向“小众化”，包括他汀类药物耐受患者，使用足量他汀类药物后无法达到治疗指标的严重高胆固醇血症如家族性高胆固醇血症患者，及他汀类药物无效的某些类型血脂异常[如高Lp(a)血症]患者等。而大多数处于潜伏发展期尚无明显症状而体内血脂水平偏高的患者而言，注射单抗来预防心血管疾病未必是首选，因此药物研发者有必要开发使用方便，口服有效的小分子类PCSK9抑制剂满足患者临床需求^[8]。

目前，基础研究领域尚未有 PCSK9小分子抑制剂的研发的报道，研究者们对开发PCSK9小分子抑制剂的可行性依然存在质疑。2015年1月Pfizer宣布酝酿研发PCSK9小分子抑制剂，成为首个进军该领域的制药巨头。近年来，亦有数家制药企业申请了PCSK9小分子抑制剂的专利如WO2011051961（Cadila Healthcare）, WO2014390195（Shifa Biomedical）,WO2014017569(Kowa Company)等,表明这一领域正受到药物研发者的关注，研发小分子PCSK9抑制剂一方面为PCSK9基础研究尤其是在介导翻译后修饰、LDLR降解的过程、生理功能多样性等研究中提供工具分子，另一方面为开发具有成药性和进一步开发价值的PCSK9抑制剂奠定基础，具有较高的研究价值与良好的应用前景。

5.对研发PCSK9小分子抑制剂的探索

2014年，Zhang等报道了通过噬菌体展示技术筛选得到的十三肽Pep2-8作用于PCSK9与LDLR发生蛋白-蛋白相互作用表面的竞争性抑制剂，其与PCSK9结合的K_d值达0.66 mu;M，抑制LDLR与PCSK9结合的IC₅₀（PCSK9与LDLR的EGF-A结构域）达到了0.44mu;M，是已知的最小的直接干扰PCSK9与LDLR结合的抑制剂。根据这一多肽和PCSK9的作用方式结合计算机辅助药物设计，我们设计了一类PCSK9的抑制剂并将尝试合成这些小分子，做进一步的生物活性评价。

同时，根据现有PCSK9的研究文献，我们认为除了PCSK9-LDLR结合部位，在PCSK9酶活性催化口袋，催化结构域，碳端结构域均有可能成为小分子的结合抑制的作用靶位，我们将结合计算机辅助药物设计尝试筛选和设计新型作用方式的PCSK9小分子抑制剂。

参考文献：

[1] Qian YW., et al. 2007. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. J. Lipid Res. 48:1488–98.

[2] Zhao Z, Tuakli-Wosornu Y, Lagace TA,et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. Am J Hum Genet 2006;79(3):514-23

[3] Naureckiences,Ma L,Sreekumar K,et al.Functional characerization of Nare I, a novel proteinase related to proteinaseK. Arch Biochem Biophys,2003,420:55-67

[4] Mcnutt M C, Lagage T A,Horton J D.Catalytic activity is not required for secreted PCAK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cels.J Biol Chem,2007,282:20799-20803.

[5]张洋,马坤岭.PCSK9在脂代谢调节中作用的研究进展.现代医学,2013,Aug;32(4):473-478

[6]Cariou B，Le May C,Gmyr V,ClinicalaspectsofPCSK9.Atherosclerosis,2011,216:258-265

[7]Sabatine M.S., Giugliano R.P., Wiviott S.D., et al. N Engl J Med (2015) 372:1500-1509

[8] NG, Seidah, et al. 'PCSK9: a key modulator of cardiovascular health.' Circulation Research 114.6(2014):1022-36.