开题报告内容：
一、背景介绍
药物在临床使用过程中会发生较为常见的药物-药物相互作用，而这也是许多药物被撤市的原因。药物-药物相互作用可发生于药物在人体内吸收、分布、代谢和排泄等过程，其中以代谢性相互作用为主。代谢性相互作用主要与参与药物代谢的酶有关。药物代谢酶即药酶，也称肝微粒体混合功能氧化酶，主要存在于肝细胞平滑肌内质网内，其中以细胞色素P450(CYP450)为主。CYP450是药物代谢最重要的酶系，起催化的氧化反应类型极广，使药物代谢最主要的途径，其介导的代谢反应占所有药物代谢的90%。根据P450分子的氨基酸序列将P450酶系进行分类，按其同源性将其分为不同亚型。在肝中主要有11种CYP450亚型同工酶参与药物代谢，分别为：CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8/9/18/19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5。其中，CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4占所有代谢反应的90%。因此，对这5种CYP450亚型的研究具有重要的意义。已有文献报道，除此5种亚型酶外，还对另外4种CYP亚型酶（CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1)进行了研究。例如，CYP2A6在尼古丁的代谢过程中起着重要的作用，它还参与了三氯溴氯乙烷、丙烷酸、氯西加酮这几种治疗药的代谢；呋喃香豆素已被证明是CYP2A6抑制剂，它广泛存在于植物中。抗癌药三亚乙基硫代磷酰胺通过抑制CYP2C8活性从而使血浆中环磷酰胺代谢活性下降；利福平对CYP2C8的底物罗格列酮产生诱导作用。在联合用药过程中，某些药物的特异性代谢酶会被联用药抑制或诱导,从而引起药物代谢的改变。药物主要是作为CYP450底物、抑制剂或诱导剂。酶诱导剂可使药酶活性增强，使其本身或其他药物代谢加快，占代谢性相互作用的23%。酶抑制剂可以使药酶活性减弱，使其本身或其他药物代谢减慢，占代谢性相互作用的70%。因此，临床最关注酶抑制剂引起的相互作用。因此，为了预防后期药物研发过程中药物候选物的淘汰现象，在新药发现的最初阶段运用CYP特异性底物对CYP抑制剂进行评估成为不可缺少的步骤。
二、研究目的
本研究院对一类抗菌药SIPI1101进行了体外药效学和早期代谢性质的评价。其中，SIPI1101在微生物和整体动物水平的有效性均接近或优于上市药物、体内外药代性质良好、整体动物耐受性较好。因而，将其选为候选化合物进一步研究。为了进一步探讨SIPI1101的作用机制，本实验使用CYP450酶cocktail系统测定SIPI1101对CYP450酶系的9种代谢酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1)活性的影响。
三、研究方法
1.注意事项
目前国内最多对5种CYP亚型同时进行评价,虽然有报道显示对9种CYP亚型进行评价的方法，但都是采用体外单底物代谢孵育的方法并且所采用的探针底物并不都是FDA所建议使用的，有的孵育时长甚至达到60min。为避免这些限制，本课题需要开发和优化一种液质联用的高通量方法对化合物的代谢型药物药物相互作用进行评价。用体外鸡尾酒探针药物法前需注意一下几个问题：（1）探针药物只被一种特定的亚型催化但已确知其各条代谢途径及其产物；（2）底物混合体系中不能产生药物相互作用并且每一个底物代谢产物都可以找到容易检测的内标。（3）CYP3A4/5具有多个底物结合位点且其结合位点具有不同的底物基团，因此其抑制动力学表现较为复杂。因此，在FDA指南拟案中建议，用1个或多个CYP3A4/5底物来检测CYP酶抑制。据相关资料报道，睾酮、咪达唑仑、硝苯地平以及非洛地平都是CYP3A4的底物且它们之间存在有相同的结合位点，而其中睾酮和咪达唑仑具有不同的结合位点。因此，我们将选取睾酮和咪达唑仑分别作为CYP3A4/5探针底物加入到混合底物中。（4）底物终浓度应接近或低于Km值；（5）反应时间不能很长以防止待测药物的代谢；（6）防止待测药物与肝微粒体进行结合，蛋白浓度要较低；（7）用来检测底物代谢物的LC-MS/MS的灵敏度需在可接受范围之内。
2.操作方法
建立同时测定人肝微粒体中9种特异性底物对应代谢产物( 对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美芬妥英、右啡烷、1-羟基咪达唑仑、6beta;-羟基睾酮、7-羟基香豆素、羟基安非他酮、6alpha;-羟基紫杉醇和6-羟基氯唑沙宗、) 的LC-MS /MS 法，并进行方法学验证。其次，对温孵体系进行优化，以确定温孵时间和微粒体蛋白浓度，用已知抑制剂对所建立的实验体系进行验证；最后，将CYP450 酶9种亚型的10种特异性探针底物非那西丁( CYP1A2) 、甲苯磺丁脲（CYP2C9）、美芬妥英( CYP2C11) 、右美沙芬( CYP2D6) 、咪达唑仑( CYP3A4) 和睾酮( CYP3A4)、香豆素（CYP2A6）、安非他酮（CYP2B6）、紫杉醇（CYP2C8）、氯唑沙宗( CYP2E1)的混合液与人肝微粒体及系列浓度的SIPIS1101溶液进行温孵反应，孵育完成后加入终止剂将反应终止，混合样品处理后，采用LC-MS/MS 法同时测定对应底物代谢产物的含量，计算相应的IC50，评价是否有抑制作用。
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