开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 课题研究背景及意义
肿瘤是一类高异质性的恶性疾病，尽管现代医学知识和医疗技术取得突飞猛进的发展，肿瘤的发病率、死亡率都呈上升的趋势。在我国肿瘤的发病率以年均 3%-5%的速度递增，预计到 2020 年，肿瘤发病人数将增至 400 万，死亡人数增至 300 万。目前肿瘤的主要治疗手段仍然是手术切除、化疗、放疗，然而对肿瘤晚期病人以及弥散性肿瘤，这些传统的治疗方法不但无法挽救患者的生命，而且其不加选择的杀伤正常组织而导致的疼痛、落发等副作用严重降低病人的生活质量。同时传统治疗方法严重削弱机体自身的免疫系统， 降低机体抵抗外源病菌入侵的能力以及无法有效防范残余肿瘤细胞的复发、转移。
进入 21 世纪以来，随着生命科学知识的累积、生物技术的进步以及与医学研究的交叉，研究人员发现肿瘤具有十个显著特征与正常细胞不同。肿瘤细胞基因组不稳定、易突变，没有正常细胞的生长接触抑制信号、能持续增殖、抗凋亡、具备永生化能力。肿瘤细胞能逃避免疫系统杀伤、诱导血管生成维持自身养分供应以及侵袭转移正常组织，同时肿瘤组织能促进炎症，而慢性炎症已经被证明是细胞转化的元凶之一。正是这十个特征赋予肿瘤的顽固难治疗性、易复发性。同时对这十个特征的研究开创了肿瘤治 疗的新纪元即肿瘤的生物治疗。肿瘤生物治疗定义为应用现代生物技术及生物制品激发、增强机体的天然防御系统或靶向肿瘤发生、发展的关键性进程来获得抗肿瘤的效应。大量研究表明肿瘤生物治疗具有不良反应发生率低、有效性强、良好机体耐受性等优点，因而更适合治疗处于瓶颈节点而状况较差的恶性肿瘤病人。
目前，在肿瘤生物治疗方面，融合蛋白展示了强大的潜力，融合蛋白分子主要包括细胞因子间的融合以及细胞因子与抗体间的融合，通常通过靶向肿瘤相关的两条免疫途径或者介导细胞因子特异性识别肿瘤细胞而发挥作用。由于肿瘤发生和发展的机制多种多样并且各种信号传导通路纵横交错，因此通过完全不同类型的机制治疗肿瘤可能得到更好的效果并不易产生耐药。
- 课题研究内容及问题
为了将具有抑制新生血管生成能力的 tum分子与激活 T 细胞的CDXL分子连接得到的融合蛋白，首先需要对tum 分子和CDXL分子的氨基酸序列进行生物学信息分析，然后设计、选择合适的链接肽linker以及融合蛋白的基因序列片段，构建合适的表达载体，选择表达系统，继而表达融合蛋白，进行蛋白的纯化及活性分析。文献和实验表明，大肠杆菌是该融合蛋白较好的表达系统，但是原核表达系统表达的真核蛋白没有得到确切修饰，空间结构往往出现错误，大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程才能恢复融合蛋白的活性。
本课题主要是针对融合蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达量，即对应的包涵体的产量，同时对包涵体纯化条件，包涵体变复性的条件进行研究。
- 课题研究方法和手段
包涵体产量方面，采取的手段主要是针对表达载体和表达系统的影响因素，通过控制变量的方法，改变表达载体的诱导时间，大肠杆菌表达系统的培养时间，培养环境等来对最终所得的包涵体产量进行比较，从而得到最佳的条件。
包涵体纯度方面，则依据包涵体的相关性质，选取合适的试剂进行洗涤，通过不同的洗涤条件得到包涵体，再进行SDS-PAGE电泳，观察并比较纯度，获得最佳的洗涤条件。
包涵体蛋白的变复性及纯化方面，变性采取高浓度的尿素溶液，然后采用柱上复性，选取葡聚糖凝胶G-75，以尿素溶液进行梯度洗脱复性，同时达到纯化蛋白的目的，通过改变尿素的浓度、复性的时间、浓度梯度的变化快慢等条件获得不同的复性结果，复性结果先采用CD检测，获得阳性结果后，进行细胞活性检测，比较复性的效果以获得最佳的复性条件。
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