一、课题背景
美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所的Joseph De Larco和George Todaro于1978年首次从鼠肉瘤病毒转化的成纤维细胞中发现了转化生长因子-beta;(TGF-beta;)。转化生长因子-beta;(TGF-beta;)是调节多种细胞过程如生长、发育和分化的多效性蛋白超家族的成员。到目前为止，已经鉴定出超过33个TGF-beta;成员，形成一个大的超家族，并分为不同的亚家族，包括TGF-beta;、激活素、骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDFs)、结节和抗苗勒管激素(AMH)。TGF-beta;超家族配体通过结合两种类型的跨膜受体，Ⅰ型(Tbeta;R-Ⅰ；也称为活化素受体样激酶，ALK)和具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的Ⅱ型(Tbeta;R-Ⅱ)受体。目前，已经鉴定了7个ALK(ALK1～ ALK7)和5个Tbeta;R-II，它们可能与每个TGF-beta;超家族成员形成特异性的杂合物。每个配体可以结合多个受体，但亲和力不同。例如，TGF-beta;以高亲和力与ALK1和ALK5结合；激活素以高亲和力与ALK2和ALK4结合，但与ALK7的亲和力中等。TGF-beta;在人类癌症的发展中起着关键和双重的作用。
在癌症的早期或初级阶段，TGF-beta;可以通过诱导细胞周期停滞和促进细胞凋亡来充当肿瘤抑制因子。大量证据表明，在恶性肿瘤的早期阶段，TGF-beta;通过上调细胞周期依赖性激酶(CDKs)抑制剂如p21和凋亡调节因子如Bcl-2样蛋白11(BIM)的表达，导致G1周期停滞并诱导凋亡。但是在癌症晚期，TGF-beta;可以起到肿瘤促进剂的作用。由于TGF-beta;途径中一些关键成分的突变，处于疾病更晚期的肿瘤细胞通常对TGF-beta;的抑制作用失去敏感性。例如，在胰腺癌患者中报道了SMAD4的高比率突变和/或缺失，并且在肝细胞癌、结肠直肠癌或肺癌患者中广泛鉴定了SMAD2的失活突变。当癌细胞对TGF-beta;的生长抑制作用产生抗性，但保持其对TGF-beta;的反应性时，配体有利于肿瘤进展，并促进EMT、侵袭和转移。TGF-beta;可以通过促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化、诱导免疫细胞的募集、驱动组织血管生成和抑制适应性免疫细胞反应来调节纤维化组织和肿瘤微环境中涉及的基质细胞的功能。
器官纤维化和癌症发展过程中的一个标志性事件是TGF-beta;介导的肌成纤维细胞分化和常驻/浸润成纤维细胞的激活，这是由促纤维化/促肿瘤细胞因子和趋化因子的分泌以及间充质/癌症相关生物标志物的表达引起的，并导致ECM的过度积累，为免疫细胞的浸润提供温床和有益于细胞(即肿瘤细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞)的前提条件。免疫细胞渗入组织微环境，通过分泌细胞因子和趋化因子进一步增强纤维化或致瘤反应，这些细胞因子和趋化因子负责肌成纤维细胞分化、刺激ECM沉积和免疫细胞的进一步募集。TGF-beta;还对大多数免疫细胞如树突细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞表现出免疫抑制作用，因此，肿瘤微环境中TGF-beta;信号的激活与不良预后有关。此外，最近的免疫逃逸研究表明，癌症相关成纤维细胞中TGF-beta;信号的转录信号有助于T细胞排斥，这导致对免疫治疗药物阿替唑单抗诱导的程序性细胞死亡-1/程序性死亡配体-1(PD-1/PD-L1)途径的免疫检查点阻断的反应较差。值得注意的是，对免疫治疗药物缺乏反应与成纤维细胞中TGF-beta;信号的激活有关。总之，在过去几十年中，已经描述了异常TGF-beta;信号在许多疾病的发病机理中的许多功能作用，因此，靶向TGF-beta;信号调节剂和/或下游效应物可能导致针对特定疾病的全新药物。过去已经使用了不同的策略来拮抗TGF-beta;的作用。针对TGF-beta;的抗体，工程改造的突变TGF-beta;配体，靶向特定TGF-beta;信号传导成分的反义寡核苷酸，核心蛋白聚糖，重组可溶性beta;聚糖和可溶性Tbeta;R-Ⅱ:Fc融合蛋白都已经被开发出来抑制TGF-beta;活性或信号传导。因此，前人的工作提供了“原理证明”,即长期抑制beta;活性可以抑制乳腺癌细胞的转移性扩散。
在吡啶类的ALK5抑制剂中，礼来公司的2个化合物(LY2157299, LY3200882)已进入临床试验，其余化合物处于临床前阶段。据报道，长期持续暴露于LY2157299可引起动物心脏毒性。因此，根据采用基于药代动力学/药效学的给药策略，建立了适当的安全性概况，以便进行临床研究。MDS治疗的临床试验表明，患者在治疗期间对LY2157299的耐受性良好(150mg,28天周期，开14天，停14天)。单疗程治疗后，26%的患者血液状况明显改善，输血需要量减少至少4个单位或血红蛋白增加至少1.5g/dL，并持续8周。在晚期肝癌和胶质瘤患者的Ⅰ、Ⅱ期临床试验中，LY2157299表现出良好的药代动力学特性和抗肿瘤疗效。在安全剂量(300 mg/d间歇性口服)下，未观察到心血管毒性。虽然有研究表明长期抑制TGF-beta;信号可能诱发继发性恶性肿瘤，但LY2157299的临床评估显示，即使在治疗3年以上的患者中，也没有发生肿瘤的迹象。LY3200882是礼来公司开发的另一种高选择性Tbeta;R-Ⅰ激酶结构域抑制剂。2016年首次在临床试验中报道，目前正在进行实体肿瘤治疗的Ⅰ期临床试验)。据报道，LY3200882在体外能显著抑制TGF-beta;诱导的肿瘤细胞和免疫细胞的SMAD磷酸化。在免疫抑制试验中，LY3200882显示了在体外恢复TGF-beta;或T调节细胞抑制的固有T细胞活性和恢复增殖的能力。在临床前，LY3200882在多种实验肿瘤模型如原位4T1-LP三阴性乳腺癌模型中表现出较强的抗肿瘤生长和转移活性，其抗肿瘤活性与肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞的增强有关。此外，在同基因CT26结肠癌小鼠中，LY3200882与免疫检查点抑制(抗程序性细胞死亡配体-1，抗PD-L1)联合表现出协同抗肿瘤活性。
- 要解决的问题
在已经作为候选药物并进行了临床前评估的Tbeta;R-Ⅰ激酶抑制剂中，GW-788388（结构见下图1）是一种具有口服活性的选择性Tbeta;R-Ⅰ激酶抑制剂，对TGF-beta;诱导的SMAD2/SMAD3的磷酸化、EMT、肿瘤细胞生长、毛细血管生成、组织纤维化、脱发、瘢痕形成和其他病理过程显示出与许多代表性咪唑和吡唑抑制剂相似的体外和体内抑制作用，尤其在肝肾纤维化模型中表现出了很强的活性，其抑制Tbeta;R-Ⅰ激酶活性的IC50值为18nmol/L。因此本课题将以ALK5抑制剂GW-788388为先导化合物进行结构改造，以期寻找更好抗纤维化活性的化合物。
（图1，GW-788388的结构）
- 研究方法和内容
查阅相关文献，对有价值信息进行汇总；运用生物电子等排体、骨架跃迁等方法进行化合物设计并合成相应化合物；利用核磁共振氢谱和碳谱对所得化合物进行结构验证等。
选择GW-788388作为先导化合物后，为了保留化合物的共轭体系，将吡啶环拆开然后拼合，其余部分进行保留，便可得到一系列以吡唑环为核心的化合物，最终设计出的化合物如下图2。
（图2，所设计的化合物）
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