建立LC-MS/MS法检测小鼠血浆中奥希替尼及其活性代谢产物AZ5104浓度
- 研究背景
非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是恶化程度高、治疗难度大的肺部癌症，其发病率占所有肺癌发病率的80%～85%。2018年统计数据显示，全球范围内新增肺癌患者超过200万人，而其中由肺癌导致的死亡事件高达近180万人。由此可见，NSCLC的发病率及致死率均较高，严重危及患者的生命健康。此外，NSCLC患者的5年生存率很低，常用的治疗方法包括手术切除、含铂化疗及放疗等，然而常用治疗手段并不能扭转NSCLC患者治疗获益较差的情况，含铂双药化疗后患者的5年生存率低于5%等。非小细胞肺癌发生常与多种相关基因靶点突变或通路异常有关，如表皮生长因子受体突变、间变性淋巴瘤激酶重排等。靶向药物的出现为NSCLC治疗提供了新方向，吉非替尼、厄洛替尼、奥希替尼、劳拉替尼及多靶点抑制剂为常见的靶向治疗药，临床试验结果也显示出一定的疗效。
奥希替尼是英国阿斯利康公司所研发而成的EGFR–TKI第三代药物,其能够针对EGFR初始突变和T790M位点突变产生同时作用,在临床当中主要用于对使用EGFR–TKI治疗后发生T790M突变的NSCLC患者。在EGFR-TKI方面，奥希替尼取得的研究成果令研究者为之振奋，其为患者带来的突出生存获益，即有效延长了PFS和OS，使其在NSCLC指南中的地位由三线用药，跃居为一线用药。AZ5104和AZ7550是奥希替尼的两种主要活性代谢产物，在体内的含量约为母体的10%。对于这两种代谢物，AZ5104在体外显示出与奥希替尼相当的药效，但对WT和突变型EGFR的体外选择性则低得多；相反，AZ7550对突变体和WT EGFR的体外效力降低，但却可以达到与奥希替尼相似的选择性。所以奥希替尼典型的EGFR毒性可能与这两种代谢物有关，特别是AZ5104。
有关奥希替尼的血药浓度测定方法国外已有报道，国内尚无奥希替尼测定的方法和其血药浓度报道。此次课题研究的内容，即为在文献的基础上，旨在建立一种快速、灵敏地测定小鼠血浆中奥希替尼以及其活性代谢产物AZ5104的浓度LC-MS/MS法，为后续奥希替尼的药代动力学研究提供方法支持。
- 研究目的及意义
通常认为像奥希替尼这类EGFR-TKI类小分子靶向药物比化疗药物更安全、有效，不良反应也少，似乎没有必要开展治疗药物监测（TDM）。但是随着此类药物的临床使用，越来越多的临床医生发现此类药物的临床使用易受患者个体差异、合并用药和患者依从性等因素影响，从而导致临床疗效差异显著。通过TDM能够很好的规避上述影响因素，从而在减少药品不良反应的情况下，保证临床治疗效果。因此，2017年美国药师协会汇总大量临床数据，编写了《肿瘤治疗中激酶抑制剂治疗药物监测实践指南》，推动抗肿瘤药物TDM的临床应用。通过针对此类药物的血药浓度监测，临床药师可以及时发现患者个体代谢差异、临床合并用药和患者依从性欠佳等实际临床用药问题，从而及时调整临床给药方案避免药物不良反应的发生，并保证患者的临床治疗效果，真正实现肿瘤患者个体化、精准化的药物治疗。
建立奥希替尼及其活性代谢产物AZ5104的PK/PD模型来理解药物浓度和靶点结合之间的联系，以及解释重复使用不可逆抑制剂后减少靶点表达如何导致肿瘤生长的变化对于研究奥希替尼在体内的药动学及药效学非常重要。而这一点则需要可靠准确的血药浓度检测方法来实现。LC-MS/MS检测方法相对于HPLC等方法具有灵敏准确的特点，可以快速同时测定小鼠血浆中奥希替尼及其活性代谢产物AZ5104的浓度。
本次课题的主要目的就是建立一个样品需求量小，普适性高，稳定，灵敏度高，线性范围宽，没有基质效应，可靠性高，适用于各种生物机制的LC-MS/MS检测方法同时测定小鼠血浆中的奥希替尼及其活性代谢产物AZ5104的浓度。
- 国内外研究现状
HPLC法是目前国内外检测血药浓度常用的方法，应用范围广泛。但是，由于使用色谱柱进行分离耗费时间较长，灵敏度较低，并不适用于高通量的生物样品分析。
在国外，Fresnais M , Andreacute; Roth, Foerster K I等人建立了MALDI–IM–MS/MS的检测方法来测定人血浆中奥希替尼的浓度，该方法与LC-MS/MS相比，主要优点是可以减少样品制备时间。然而，缺乏色谱分离会极大地影响测量的特异性，从而影响灵敏度。因此要采用这种测定方法，则必须尽可能多地采用样品制备程序；Marijn G D , Veerman, Mei H等人建立了LC-ESI-MS/MS法快速准确测定人血浆中奥希替尼及其代谢物AZ5104的方法，该方法优化了LC-MS/MS条件，提高了灵敏度和稳定性，通过对患者样本中奥希替尼和AZ5104的分析，结果得到了成功的验证，这是第一个同时检测这两种化合物的已发表的有效检测方法。此方法还成功地应用于人血浆中奥希替尼及其代谢物AZ5104的测定，以筛选参加新药临床试验的受试者是否曾接受过奥希替尼治疗。
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