开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、拟研究问题
从临床前药理学研究内容来看,天然抗肿瘤药物研究的内容主要包括:抗肿瘤活性物质的筛选与发现,抗肿瘤作用的进一步评价,药物作用机制的研究。其中本课题所研究的抗肿瘤活性物质的筛选是天然抗肿瘤药物研究的基石。
二、研究手段
1.体外细胞培养
细胞经常规复苏后置于培养箱中在37 ℃，5% CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞生长至指数生长期时，吸除瓶内旧培养液，用PBS洗2次，去除残留培养液，再向瓶内加入适量消化液(0.25%胰蛋白酶)，使消化液浸没所有细胞表面，置37 ℃培养箱中孵育。时间视不同细胞而定，置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含10%胎牛血清的完全培养液终止消化，离心(1000 X，5min)后去除上清液，用培养液重悬细胞后计数，以细胞数3 x 105~ 5 x 105 cells/mL接种在新的培养瓶内，置于培养箱中以上述培养条件培养，2~3 d传代一次。
2 MTT法检测细胞活力
细胞生长至指数生长期时，以0.25% 胰蛋白酶消化，1000 X离心5min，细胞沉淀用完全培养基调细胞数为2 x 104~ 3 x 104 cells/mL，在96孔培养板每孔接种190 L， 37 ℃，5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h后加入不同浓度的Calyxin Y或者5-FU，使终体积为200 L，每浓度设6个复孔，对照孔加入等量培养基，继续培养24 h，再加入20 L浓度为5 mg/mL的MTT，置于CO2培养箱37 ℃孵育，4 h后弃去培养液，每孔加入150 L DMSO，在培养板平台振荡机上振荡10 min，置酶标仪中以570 nm为检测波长，630 nm为参比波长测定各孔的OD值，计算各给药浓度的抑制率，实验重复3次，Calyxin Y或者5-FU对受试细胞株的IC50用SPSS 11.5软件按机率单位加权回归法(Bliss法)计算。
抑制率的计算公式：
抑制率(%)=(1-加药孔平均OD值)/对照孔平均OD值x l00%
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