针对p53/EGFR的双靶点抗胰腺癌化合物的虚拟筛选及靶点验证文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题目的

胰腺癌的非手术治疗主要包括化疗、放疗或联合放化疗。以吉西他滨为基础的化疗方案是近年来胰腺癌化疗的标准方案，但无论是以吉西他滨为核心的放(化)疗方案或其他治疗方案还远未达到完美程度。近年分子靶向药物发展迅速，本项目拟通过计算机虚拟筛选，挑选出若干对EGFR和p53双靶点结合作用效果良好的多靶向化合物，并进行靶点验证，探索针对p53/EGFR的双靶点胰腺癌药物的开发思路。

二、研究内容和手段

2.1细胞培养方法：

胰腺癌细胞系有AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1和 PANC-1。PANC-1和BxPC3细胞系用RPMI-1640培养基，PANC-1 细胞系用DMEM培养基，CFPAC-1细胞系用IMDM培养基，上述细胞在含10%胎牛血清、0.1units/mu;L青霉素和0.1mu;g/mu;L链霉素培养，在37C 二氧化碳培养箱中，CO₂浓度为5%，相对湿度为95%环境。

2.2细胞活力测定方法

细胞活力测定采用MTT法，测定在96孔细胞培养板中进行，具体步骤：取对数生长的胰腺癌细胞消化、离心和配制比例为110⁴/孔稀释液，每孔150 mu;L接种于96孔板中，孵育24小时后至细胞贴壁良好，为下步细胞给药做准备。将待测化合物0.5mu;L体积共同孵育72小时，相同体积0.5mu;L DMSO为阴性对照。每孔加入10mu;L浓度为5mg/mL的MTT溶液，37C继续培养4h。每孔加入100 mu;L Formazan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育。直至在普通光学显微镜下发现formazan全部溶解。测定570nm波长下的吸收率的细胞活力。IC₅₀值利用GraphPad Prism软件进行计算。

三、主要成果形式

3.1 完成各细胞系的培养并完成靶点验证；

3.2 完成毕业论文撰写。

四、进度安排

2017.2-2017.3 文献查阅，准备实验材料，了解并熟悉实验操作；

2017.4-2017.5 完成细胞培养和活力测定；

2017.5-2017.6 整理数据，撰写论文，完成答辩。

五、文献综述

胰腺癌是最致命的实体恶性肿瘤之一，5年生存率低于5％[^1]。即使用手术治疗和标准的一线化疗药物吉西他滨（GEM），患者的中位生存期仅为7.2个月[^2]。因此，迫切需要新的治疗方法来治疗这种致死性疾病。

手术根治性切除仍是目前最有效的治疗方式，但根治术后早期转移复发造成手术预后不良。以吉西他滨为基础的化疗方案是近年来胰腺癌化疗的标准方案，但胰腺癌患者容易对现有化疗药物产生耐药。

EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体，属于酪氨酸激酶型受体，位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，靶向于激活突变体的第一代EGFR抑制剂（厄洛替尼和吉非替尼）已经证明在EGFR突变的NSCLC治疗中具有显著的初始临床反应速率^[3][4]。约60％的获得性抗性产生于EGFR激酶结构域内的关守残基Thr790至甲硫氨酸（T790M）的次要点突变 ^[5][6]。这种突变在保持酶的催化功能的同时，通过阻断一部分这些分子的结合位点，增加激酶对ATP的亲和力，降低了厄洛替尼和吉非替尼的抑制作用^[7]。这表明了在第一代EGFR抑制剂治疗取得最初的进展后，持续抑制EGFR活化突变体的重要性。

p53是一种肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene），是人类肿瘤中出现频率最高的肿瘤抑制基因。p53蛋白作为转录因子，起到刺激细胞周期阻滞、DNA修复或细胞凋亡等响应各种细胞应激信号的作用^[8][9][10]。P53蛋白含有DNA结合核心结构域、 N-末端反式激活结构域、四聚体结构域和碱基C末端结构域^[11]，核心结构域由一个限定DNA结合表面的平行支架组成^[12]。大约一半的人类肿瘤细胞携带突变体p53等位基因，其中约70％是位于核心结构域的单位点错义突变^[13]。野生型p53发生基因改变即成为突变型p53。突变型p53蛋白失去阻滞细胞周期或诱导细胞凋亡的能力，获得了促进细胞恶性转化的功能，还可能通过干扰野生型p53蛋白的功能而影响细胞生长。其有三个核心域错义突变表型，主要以其热力学性质和DNA结合性质来分类。已有相当大的努力被投入来设计能够恢复这些突变的p53蛋白质的正常细胞功能的药物，研究人员使用系统的遗传方法来了解如何设计这些药物，将野生型功能恢复到未发挥功能的p53突变体上^[14]。有三个设计合理的突变抑制类别，分别与三类癌症突变相对应：（i）提供额外接触以结合DNA的转变；（ii）补偿局部结构中断的转变；（iii）稳定整个核心结构域结构的转变。

目前针对EGFR及其信号传导通路的治疗方法有单克隆抗体、酪氨酸蛋白激酶抑制剂等，阻断下游酪氨酸激酶/酪氨酸信号转导通路，来抑制肿瘤细胞生长；为了持续抑制EGFR活化突变体，找到一种EGFR激酶结构域突变体的T790M抗性双突变体和EGFR激活单突变体的活性的抑制剂很有必要。而针对p53靶点的治疗，由于癌症突变数量巨大，筛选特异性突变体抑制剂以纠正每个癌症突变体单独引起的缺陷是不切实际的。在p53的第三类突变中，挽救几种有破坏稳定性效应错义突变，稳定第二位点抑制突变，是更广泛更有效的拯救机制的希望所在

。用合适的化合物与p53的核心突变区域4LOF相互作用使其变构，恢复野生型的活性，是我们药物分子筛选的思路。据此，利用筛选出的小分子化合物，测试其同时作用于EGFR、p53双靶点的效果，尝试从多个方面抑制肿瘤细胞生长，是本课题期望达到的目标。

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