重要药物中间体5-氨基-2,4-二氯嘧啶的制备文献综述

 2023-02-10 20:16:59

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一、研究背景：

PKs 是一种催化蛋白质的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上的羟基磷酸化的酶。这些激酶的一个重要子集，即蛋白质受体酪氨酸激酶(RTKs或RTK)，主要作为生长因子受体，并在信号转导途径中发挥中心作用，整合了许多细胞功能，如细胞周期、细胞生长、细胞分化和细胞死亡。在与免疫系统疾病相关的更具体的环境中，RTKs 为髓样和淋巴样 DCs 的扩展、增殖、分化、激活和转运提供了一种转换机制。在这方面，Flt3 和 CSF- 1r 受体及其配体生长因子 Flt3L 和 GM- CSF 尤其值得关注[1]。反过来，巨噬细胞，小胶质细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞，T-reg 和 T-helper 细胞各具有不同的表型，包括目前广泛认可的自身免疫介导的 Thl7 细胞亚群，是受 RTK 信号控制的过程。树突状细胞之间的联系作为细胞靶标（即作用方式）与 RTKs 作为分子靶标（即作用机理）之间的 RTK 抑制作用已在多项研究中得到证明，可以看作是理解所有此类免疫的范例具有相似的细胞和分子病因的系统疾病。

Flt3 可以抑制免疫应答，可能通过抑制 DCs 诱导的 T 细胞的刺激，并且可以考虑用于治疗自身免疫疾病[2]。与对 DCs 作为免疫调节剂的作用的这种日益了解相一致的是，现在广泛理解 DC 的发展本身很容易受到几类蛋白激酶小分子抑制剂（ PKs或PK）的调节[3]。Flt3 抑制剂已用于临床开发，例如 Gilteritinib[4]

另外相关文献记载 Pim 激酶，包括 Pim1、2 和 3，是丝氨酸/苏氨酸激酶，其通常响应于生长因子和细胞因子而在造血细胞的存活和增殖中起作用，因此具有在癌症治疗和骨髓增生性疾病中的潜在作用。同时 Pim 激酶的抑制剂还可用于控制其他病理状况，例如自身免疫性疾病，变态反应和器官移植排斥综合征中免疫细胞的扩增。Pim 激酶参与了辅助性 T 细胞的早期分化过程，该过程协调了自身免疫性疾病，变态反应和组织移植排斥反应中的免疫反应。有研究证实,炎症条件下 PIM1 激酶可以特异性催化 FOXP3 蛋白 Ser422 位点磷酸化,该位点特异性磷酸化会减弱FOXP3 与染色质结合的能力,从而降低其转录调节活性。利用 shRNA 下调 PIM1 的表达或 PIM1 抑制剂处理 Treg 细胞均可以显著增强 Treg 细胞的免疫抑制活性[5]。

5-氨基-2,4-二氯嘧啶，CAS 号为 5177-27-5，可作为合成嘌呤类免疫抑制剂以及嘧啶类 PIM 激酶抑制剂的中间体，专利[6]实施方案提供了一种嘌呤类化合物，可以调节 RTK 的活性，例如 Flt3，CSF-1R 等，还可以直接调节树突状细胞成熟和活化，从而影响 Th17 / Treg 比率的平衡，对维持正常免疫应答及防止自身免疫具有重要意义。如图一，是此类嘌呤化合物的合成路线。

图一 以 5-氨基-2,4-二氯嘧啶为中间体制备嘌呤类免疫抑制剂

另外，专利[7]以 2,4-二氯 5-硝基嘧啶为原料，经过还原反应制得 5-氨基-2,4- 二氯嘧啶为中间体，合成化合物

(S)-4-(4-(3-amino-piperidin-l-yl)-1,7-naphthyridin-6-yl)-2-(2-flu orophenyl)-pyrimidin-5-amine，如图二，该化合物可作为 PIM 激酶抑制剂，对PIM 激酶的 IC50(mu;M)分别为 PIM1=0.004,PIM2=0.059,PIM3=0.003.PIM 激酶包括Pim1、2 和 3，是丝氨酸/苏氨酸激酶，Pim 激酶的底物包括凋亡调节剂，例如 Bcl-2 家族成员 BAD，细胞周期调节剂，例如 p21Cip1 / WAF1，C-TAK，NuMA 和蛋白质合成调节剂4EBP1，所以这种抑制剂除了在癌症治疗和骨髓增生性疾病中的潜在作用，还可用于控制其他病理状况（例如自身免疫性疾病，变态反应和器官移植排斥综合征）中免疫细胞的扩增。

图二 Pim 激酶抑制剂

二、合成路线：

文献报道有以下几种路线均可制备 2,4-二氯-5-氨基嘧啶。R：Reagent（反应试剂）

S：Solvent（溶剂）

RT 或 rt：Room temperature（室温）

以2,4-二氯-5-硝基嘧啶原料按如下条件经一步反应制备得到，产物收率为 80%。

R：2,4-二氯-5-硝基嘧啶 铁 S:乙酸，RT，14h

2.以 5-氨基尿嘧啶为原料，收率为 11%[8]，反应路线如下图：

R：5-氨基尿嘧啶 N,N-二甲基苯胺 S:三氯氧磷，17h

三、拟采用的实验操作

  1. 以提高产物收率及纯度为目的，同时为之后的工业化生产提供理论基础，故拟采用上述制备方案的一步制备法进行方法真实性确认，步骤如下：

将浓度为 0.4 M的 2.4-二氯-5-硝基-嘧啶（1.0 eq）和铁（6.0 eq）在乙酸中的异质溶液剧烈搅拌 14小时。然后使混合物通过硅藻土垫，用 MeOH洗脱。真空除去挥发物后，将残余物溶于 EtOAc，用 NaCO3（饱和），NaCl（饱和）洗涤， 用 MgSO4干燥，过滤，真空除去挥发物，得到 5-氨基-2,4-二氯嘧啶。（80％）

2.对最终产物作出核磁谱图，与文献报道应一致。

3.将少量样品与标准 5-氨基-2,4-二氯嘧啶以同种溶剂溶解，并置 于高效液相色谱仪中监测，两者保留时间和峰型应保持一致，此时样品纯度即为标准品纯度，应当不小于 95%。

4.改变原文献中的反应温度，溶剂，反应时间，分离等条件进行多组对照实验，开发出提高产物收率的最佳各条件组合，并应满足纯度不低于 95%。

5.以原投料量重复条件优化后的试验至少三次，验证试验方法的稳定性。

6.以原投料量十倍及以上的量进一步进行试验，以验证投料量对优化后的方法稳定性的影响。

7.最终得到较高收率和较高纯度的产物。

四、研究意义和目的：

正常的免疫调节能够协调自身耐受和自身免疫，使二者相辅相成，并且处于一个合适的状态。当某种原因使得对机体自身的抗原产生了免疫应答，并对相应的自身组织器官造成损伤或者使其产生功能障碍时，我们把这一大类疾病称为自身免疫病（autoimmunedisease,AID）。这种病理状态，是一类以局部或全身性异常炎症免疫反应为特征的炎症免疫性疾病。包含了 70 余种疾病，例如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、干燥综合征、强直性脊柱炎、慢性活动性肝炎、支气管哮喘等，而且其发病率高，全球有 7.6%～9.4%的人群患有各种类型的自身免疫病。据报道，现在的 AID 治疗手段主要是运用糖皮质激素以及免疫抑制剂治疗，但是这种治疗方式对 20%～30%的难治性患者没有效果，2～5 年死亡率为 25%～35%[9]。因此，积极探索更有效的治疗手段对难治性 AID 患者具有重要意义。

上述文献提及的实验利用硅藻土垫，甲醇洗脱的方式分离产物，仅适用于在实验室中进行少量制备而不适用于工业大生产，故应通过试验条件的优化开发出适合大量生产以及可以得到高纯度的 5-氨基-2,4-二氯嘧啶的具体制备方法，这将大大推动理论研究与临床药物治疗的关联，有助于找到更有效，不良反应更少的免疫调节剂。

参考文献：

  1. DiorKingston, MichaelASchmid,NobuyukiOnai,等. Theconcerted actionof GM-CSF and Flt3-ligand on[J]. Blood, 2009,114(4):835-843.

  2. Whartenby KA, Calabresi PA, McCadden E, 等 . Inhibition of FLT3 signaling targets DCs to ameliorate autoimmune disease.[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 102(46):P.16741-16746.

  3. Gaestel, Matthias, Kotlyarov, Alexey, Kracht, Michael. Targeting innate immunity protein kinase signalling in inflammation[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 8(6):480-499.

  4. 朱文婷,白秋江.FLT3 突变型急性髓性白血病的靶向治疗药物吉列替尼[J].中国药业,2020,29(03):74-77.

  5. 李志远, 林芳, 李斌. PIM1 激酶抑制剂在治疗自身免疫性疾病的临床应用价值[C]// 全国免疫学学术大会. 0.

  6. DCAM PHARMA INC; AJAMI, Alfred, M.; DUNCAN, Kenneth, W.; FANG, Xinqi n（WO2011/106168, 2011,A1）

  7. 专利Burger,Matthew;Lindvall, Mika US2011/195980, 2011, A1

  8. 专利 NeurocrineBiosciences Inc.US5795905,1998,A

  9. 张 玲 玲 . 治 疗 自 身 免 疫 病 药 物 研 究 进 展 [J].中 国 药 理 学 通 报 ,v.35(02):149-156.

资料编号：[376616]

一、研究背景：

PKs 是一种催化蛋白质的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上的羟基磷酸化的酶。这些激酶的一个重要子集，即蛋白质受体酪氨酸激酶(RTKs或RTK)，主要作为生长因子受体，并在信号转导途径中发挥中心作用，整合了许多细胞功能，如细胞周期、细胞生长、细胞分化和细胞死亡。在与免疫系统疾病相关的更具体的环境中，RTKs 为髓样和淋巴样 DCs 的扩展、增殖、分化、激活和转运提供了一种转换机制。在这方面，Flt3 和 CSF- 1r 受体及其配体生长因子 Flt3L 和 GM- CSF 尤其值得关注[1]。反过来，巨噬细胞，小胶质细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞，T-reg 和 T-helper 细胞各具有不同的表型，包括目前广泛认可的自身免疫介导的 Thl7 细胞亚群，是受 RTK 信号控制的过程。树突状细胞之间的联系作为细胞靶标（即作用方式）与 RTKs 作为分子靶标（即作用机理）之间的 RTK 抑制作用已在多项研究中得到证明，可以看作是理解所有此类免疫的范例具有相似的细胞和分子病因的系统疾病。

Flt3 可以抑制免疫应答，可能通过抑制 DCs 诱导的 T 细胞的刺激，并且可以考虑用于治疗自身免疫疾病[2]。与对 DCs 作为免疫调节剂的作用的这种日益了解相一致的是，现在广泛理解 DC 的发展本身很容易受到几类蛋白激酶小分子抑制剂（ PKs或PK）的调节[3]。Flt3 抑制剂已用于临床开发，例如 Gilteritinib[4]

另外相关文献记载 Pim 激酶，包括 Pim1、2 和 3，是丝氨酸/苏氨酸激酶，其通常响应于生长因子和细胞因子而在造血细胞的存活和增殖中起作用，因此具有在癌症治疗和骨髓增生性疾病中的潜在作用。同时 Pim 激酶的抑制剂还可用于控制其他病理状况，例如自身免疫性疾病，变态反应和器官移植排斥综合征中免疫细胞的扩增。Pim 激酶参与了辅助性 T 细胞的早期分化过程，该过程协调了自身免疫性疾病，变态反应和组织移植排斥反应中的免疫反应。有研究证实,炎症条件下 PIM1 激酶可以特异性催化 FOXP3 蛋白 Ser422 位点磷酸化,该位点特异性磷酸化会减弱FOXP3 与染色质结合的能力,从而降低其转录调节活性。利用 shRNA 下调 PIM1 的表达或 PIM1 抑制剂处理 Treg 细胞均可以显著增强 Treg 细胞的免疫抑制活性[5]。

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