开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题来源：自拟课题
课题依据：氧化应激过程中活性氧(ROS)的产生是包括心血管疾病在内的很多疾病发病或导致疾病加重的主要因素。本课题主要研究在ROS（H2O2）增加血管通透性的影响下，汉黄芩素对于此种状况下的作用。
课题主要实验理论：
1通过免疫荧光染色和高分辨率激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架
实验方法：纤维形肌动蛋(F-肌动蛋白）白是根据先前报道的方法进行的（Jalimaradaetal.,2009;Qianetal.,2005），简单地说，将人脐静脉内皮细胞接种于盖玻片。达到融合后，用不同浓度（1，10，或100mu;M）汉黄芩素将细胞预培养4小时，之后用0.4毫摩尔过氧化氢处理1小时。用4％多聚甲醛固定20分钟，在0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚中透化10分钟。然后，放入含1％牛血清蛋白的聚苯乙烯中培养，用来阻断非特异性结合。随后细胞与异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽共轭体（特别用于纤维形肌动蛋白），用1:30稀释在37℃下保温处理1小时。然后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用，4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI染色。最后，加入防褪色试剂（MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR）和激光共聚焦扫描显微镜拍摄(FluoviewFV1000,Olympus,Tokyo,Japan).
2.观察白蛋白吸收的内吞作用
实验方法：如前所述，进行吸收实验（agawaetal.,2008）。简要地说，人脐静脉内皮细胞在24孔板中生长融合成单层细胞。然后用用不同浓度（1，10，或100mu;M）汉黄芩素将细胞预培养4小时，之后用0.4毫摩尔过氧化氢处理1小时。在用磷酸盐缓冲液冲洗后，细胞用50mu;g/mL异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白在37度下培养1小时。然后，用4％的多聚甲醛固定细胞，用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)来染色细胞核。之后用激光扫描共聚焦显微镜进行观察和拍摄的图片。
3跨内皮细胞迁移实验
实验方法：如前所述跨内皮迁移分析（Eumetal.,2004）。简单地说，接种细胞量为1104人脐静脉内皮于Transwell聚碳酸酯过滤器（6.5mmindiameter,8mu;mpore-size,CorningCostar,Cambridge,MA）。达到融合后，用不同浓度（1，10，或100mu;M）汉黄芩素将细胞预培养4小时，之后用0.4毫摩尔过氧化氢处理1小时。然后，MDA-MB-231细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在最终浓度为5105个细胞/毫升的L-15中的无血清培养基中。将细胞悬浮液放置在上部隔室中，并在下部隔室中加入含10％胎牛血清的培养基。在37℃下5％CO2中保温处理4小时，将上表面上的不迁移细胞用棉签除去。下层表面上迁移的肿瘤细胞用100％甲醇固定并用苏木精和曙红染色。迁移的细胞通过手工计算进行量化，并为每个组随机选择5个进行分析。
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