开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
实验预期
抗肿瘤活性物质CPU-111经小鼠肝癌移植瘤模型初筛可知，可明显缩小肿瘤体积，与阳性药环磷酰胺相比具有更好的抗肿瘤效果。所以在前期进行了药理和药效学的研究基础上，对已明确具有抗肿瘤活性药物CPU-111进行初步研究该活性物质在动物体内的组织分布情况，并建立和优化体内分析方法。
研究内容
往届已经对通过细胞水平的药物进行筛选，得到了101、103、111、112 四个活性较好的化合物。发现化合物普遍对肝癌细胞株具有更好的活性，且对正常肝细胞的作用明显弱于对肝癌细胞株的作用。而在其中通过构建小鼠肝癌移植瘤模型，发现111 号化合物能够明显抑制肿瘤的生长，并且小鼠体重未见明显下降。已经通过光学显微镜等观察手段初步确立了111 号化合物能够通过线粒体通路诱导凋亡，具有良好的药理活性。随后建立了RP-HPLC测定大鼠血浆中CPU-111的方法，测定了其在SD大鼠中尾静脉给药后的血药浓度-时间曲线，并得到了其主要药代动力学参数，得到初步的结论：CPU-111在大鼠体内过程符合二室模型，分布比较快速，代谢较为缓慢。之后通过分子成像仪研究给药后各组织中活性物质的浓度，其中CPU-111含量最高的组织为肝， 脑、肺和骨骼肌次之，肠、胃含量变化相近。
接下来的研究主要侧重在研究CPU111的给药方法和其在组织中的不同寻常的分布。CPU-111脂溶性极好，在水中溶解不好，传统给药方式会使其剂量较小。但其在DMA中溶解度极佳，可以从适宜的有机溶剂入手提高溶解度，方便给药并且在液相中提高灵敏度。 CPU-111不同于普通药物在脑中分布较高，原因可能不仅是脂溶性好，更有可能是与体内某种物质结合，使其易透过血脑屏障。作为该化合物的特殊性质，需要我们深入研究。这是两个接下来的工作重点。
未来的工作计划我目前是这样规划的：
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第1周 |
准备工作，熟悉动物实验操作和液相 |
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第2-3周 |
练习大鼠、小鼠尾静脉注射，大鼠眼眶取血并采集空白样本，练习液相操作 |
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第4-5周 |
研究血浆组分对样品的影响，开始设计实验细节，研究流动相配比 |
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第6-9周 |
大鼠给药，制作标曲，测量血药浓度随给药时间的的变化 |
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第10周 |
使用DAS1.0药动学软件进行曲线拟合 |
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第11-12周 |
完成毕业论文 |
研究手段
应用动力学原理和数学处理方法，对药物体内过程的量变规律进行研究是药代动力学的核心内容。具体来讲就是在理论上创造了一个模型，提出了类型的合理依据，特殊解决方案的计算模型和一般解决方案，一系列重要的公式推导和输入和输出的建立，包括体外和体内 药代动力学和药效学关系，两个参数是：在实验中，未知药物，根据体内药物液体样品给药浓度或老化效能选择活体模型，计算模型中的相关参数，模型和实验价值是紧密嵌入的，模型适合; 三是应用动态参数，即根据已知药物的参数，动力学公式的应用，设计理想的准备和合理的剂量方案。
文献综述
众所周知，半个世纪以来，陆栖微生物早就已经成为生物活性物质的重要来源，例如抗生素、酶抑制剂等，一度形成了辉煌的抗生素时代。【1】但是我们目前处在一个停滞不前的时期，主要是因为研究方法创新的滞后和筛选模型陈旧，导致了寻找新种属的微生物或有特殊机能性状的微生物的几率大幅降低，与此同时，新型药物开发的几率也大幅下降，但同时海洋微生物受到了重视，或将成为下个世纪开发新型药物的重要资源。海洋特殊的生存坏境（高盐、高盐、缺氧、缺光照）决定了海洋生物的多样性，也决定了化合物的多样性。【2】了解海洋药物的发展方向，结合海洋药物的临床应用，对于我国进一步挖掘中国传统医药理论，指导临床用药，都具有重要的科学意义和社会经济价值。
1.海洋细菌
从不同海域的海水、海泥和海洋生物中分离海洋细菌, 利用琼脂扩散法和MTT 法对细菌培养液的乙酸乙酯提取物进行了抗菌和细胞毒活性筛选, 并对具有细胞毒活性的细菌菌株进行了16S rRNA系统发生学分析和多聚酮合酶(PKSⅠ型)、非核糖体肽合成酶(NRPS)的筛选。【3】结果显示, 在分离到的 346 株海洋细菌中, 42株细菌具有抗菌活性, 12株具有细胞毒活性。对这 12株具有细胞毒活性的细菌菌株进行进一步的 PKS和 NRPS筛选, 得到了 4 株含有 PKSⅠ型的 KS 结构域或NPRS 的 A 结构域的海洋细菌, 为从聚酮和非核糖体肽等生物合成途径去深入研究其次生代谢产物提供了基因学的证据。
1.1 抗菌性
海洋生物中的附生微生物与宿主之间有着紧密的联系。它们一方面可以从其动植物宿主中获得必需的各种维生素、多糖、不饱和脂肪酸等营养, 另一方面可以产生某些物质(如抗生素、毒素等),释放于水体中,以利于宿主生长代谢或增强宿主的抵抗能力 。另外 , 在相关的报道中也发现某些宿主可以通过生产某种化学物质来调节其体内的附生微生物以适应其周围的环境变化相反, 附生微生物也可以通过抑制宿主的细胞生长或者直接攻击宿主, 而影响或控制宿主的生长和发育。本实验中 ,来源于无脊椎动物和海藻的附生微生物细菌的活性菌株的百分比高于来源于海水和沉积物 。这说明了一些防御能力较差的动、植物能在海洋环境中生存, 除了自身具有的生存机制外, 其附生微生物也扮演了一定的保护性角色 。
1.2 细胞毒活性
放线菌作为生物活性代谢产物的主要来源而一直倍受关注,主要以链霉菌研究得最多。这归功于人们对链霉菌生理研究的深入并进一步对链霉菌的大量筛选工作的开展。但随着大多数链霉菌菌株已被反复研究 , 从中发现新化合物的机率在逐渐降低。近年来发现的新抗生素中 , 稀有放线菌的数目已超过链霉菌 。【4】例如小单孢菌产生的庆大霉素等也已用 于临床。红树林有着独特的生态环境 , Wu等的研究表明从红树林土壤中分离到链霉菌属 、小单胞菌属 、链轮丝菌属、诺卡氏菌属和红球菌属 5个属 ,其中链霉菌和小单胞菌在数量上占绝对优势目前我们对放线菌,特别是稀有放线菌的生理 、生态知识了解还比较贫乏 ,也由于我们对稀有放线菌的分离没有采取特殊的方法 。
1.3 抗肿瘤活性成分
肿瘤已成为威胁人类生命的第二大杀手，尽管现在使用的抗肿瘤药物种类繁多，但由于存在药物毒性、作用差异和交叉耐药等问题，亟待开发具有新型作用机制的抗肿瘤海洋药物。【5】作为生命的发源地，海洋具有丰富的生物多样性。多数无脊椎动物（如贝类和海绵类）不具有天然抵抗力，即内在免疫系统，需要合成具有生物学活性的次级代谢产物以获得相应的功能。这些代谢产物在保护宿主的生存和适应极端环境方面起着重要的作用，也是近年来药物研发的热点。【6】由海洋生物提取、制备的抗癌药物作用于恶性细胞的标志性特征被归纳为：①易于对生长信号满足；②对拮抗生长的信号产生的效应不敏感；③对细胞凋亡机制的逃避；④不受限制的增殖能力；⑤持续的新生血管生成；⑥具有浸润与转移的能力。
2 HPLC研究体内药代动
2.1 HPLC单用
在HPLC 法测定大鼠血浆中色胺酮的浓度及药代动力学参数中，采用相应的色谱条件，内标物为桂皮醛。按 56 mgkg－1 剂量给大鼠灌胃后，用 HPLC 法测定给药后不同时刻大鼠血浆中色胺酮的浓度。【10】采用 DAS软件分析，计算药动学参数。结果色胺酮在 0. 0183 ～1. 1712 mgL－1 范围内线性关系良好 (r 2 = 0. 999)，最低定量限为 0. 02 mgL
－1 。回收率大于95. 0%，其日内、日间 RSD 均小于 8%。本方法操作简便，准确，灵敏度高、重复性好，可用于色胺酮血药浓度检测及药代动力学研究。
在HPLC测定冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠肝脏中的药物浓度中，小鼠肝脏匀装液用醋酸乙酯提取,氮气挥干,残渣用甲醇溶解后进样，外标法定量。【8】该方法简便、灵敏、准确,适用于冬凌草甲素肝靶向制剂的肝脏药物浓度侧定及肝脏靶向性评价。而在冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠体内的组织分布及兔体内的药代动力学中，建立生物样品中冬凌草甲素的 HPLC测定法, 比较冬凌草甲素普通注射液和固态类脂纳米粒注射液的体内分布特点与药代动力学参数。【9】冬凌草甲素固态类脂纳米粒在肝、脾、肺、心及肾中的相对摄取率分别为 4.25%, 3.44%, 1.19%,0.52%和 0.60%。 静脉注射后的药-时曲线表明体内过程符合三室模型。冬凌草甲素固态类脂纳米粒能够增强药物的肝脾靶向性, 提高药物生物利用度, 并在一定程度上延长药物在动物体内的循环时间。 固态类脂纳米粒可能成为冬凌草甲素的一种新型药物载体。
在HPLC法同时测定灌胃黄芩水煎剂后大鼠血浆中黄芩苷和汉黄芩苷的质量浓度及药动学研究中，大鼠ig黄芩水煎剂后 ,不同时间眼底静脉丛取血 ,制备血浆。血浆样品经甲醇沉淀蛋白 , HPLC-UV 测定血药浓度。【11】大鼠 ig 黄芩水煎剂后血浆中黄芩苷和汉黄芩苷质量浓度存在双峰现象 ,黄芩苷的口服清除率大于汉黄芩苷。
2.2 HPLC联用
在HPLC-荧光检测法测定大鼠血浆中大黄酸的浓度及其药代动力学中，血浆样品经乙醚萃取后, 用 HPLC-荧光法(HPLC-FLD 法)进行测定分析。【7】大黄酸的血药浓度在 0.052～ 80mu;g/mL 范围内线性关系良好, 最低检测限为 2 ng/mL, 以质控样品计算, 在各浓度水平下, 此法的回收率均大于85%, 日间和日内精密度小于15%, 符合生物样品分析要求。 大鼠灌胃大黄酸 70 mg/ kg 后, 血药浓度-时间曲线呈二室模型。该法操作简便、快速、灵敏, 适用于对微量生物样品进行大批量测定。
3 分子成像
分子成像是近来新出现并迅速发展的一个生物医学领域,用它来显示和测定活体内生物过程在细胞和分子水平上的特征,可为深入揭示生理和病理过程的机制,以及对疾病及其治疗进行实时、动态、细致、无创、靶向性的探测和跟踪提供有效手段。【12】预计在不远的将来,分子成像技术的迅速发展可能会带来临床医疗的重大变革。荧光分子成像技术以低成本、简单易行、对生物体无电离辐射等优势在活体中进行疾病观察、药物及生物学等研究中发挥越来越重要的作用。【13】对荧光分子成像技术中几个重要的部分，包括荧光分子探针、成像系统、重建算法等方面的内容和进展做了简要的描述，并介绍了荧光分子成像技术的应用和发展趋势。
4 去除蛋白干扰
甲醇沉淀法可简便有效地去除人血清中清蛋白等HAP，为进一步行血清蛋白质组学分析奠定基础。【14】用不同体积的甲醇处理血清样品，然后与原血清样品上样进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析，并对去除 HAP 后的样品进行蛋白定量检测。 结果 SDS-PAGE 显示，经甲醇处理过的血清样品与原血清电泳结果相比，相对分子质量在 50000 ～80000 间的清蛋白等 HAP 被明显去除，血清清蛋白平均浓度显著降低，由(47．65 0．35)g /L 下降至(1．16 0. 08)g /L，去除率达 97%以上，占血清总蛋白质比例由 65． 4%下降为 49． 3%，其差异具有统计学意义(P ＜0.01)。同时一些被 HAP 掩盖的低丰度蛋白质(low abundant proteins，LAP)有所显现和保留。
当生物样品的浓度很低或样品中盐浓度gt; 0. 1 mol L - 1 ,需要对待测样品溶液进行浓缩或除盐 .最常用的方法是三氯乙酸 ( TCA)沉淀法. 实验中我们观察到TCA 对蛋白质的结构稳定性有较大的影响 ,它可使蛋白质分子间相互聚集或断裂成碎片 ,干扰分析结果的准确性。【15】
【1】方金瑞；海洋微生物：开发海洋药物的重要资源；中国海洋药物，1998年第3期
【2】盛晓波；海洋药物的开发和应用；内蒙古中医药，2010年6月18日
【3】朱鹏,郑立,林晶,邵健忠,严小军；抗菌和细胞毒活性海洋细菌的筛选及其次生代谢基因证据；微生物学报，2007 年4月4 日，47 卷2 期
【4】刘丽华，沈振国，阮继生，洪葵；26株具有细胞毒活性的海洋放线菌的系统发育研究
【5】薛冰璇，刘莉莉，李思东；海洋药物抗肿瘤活性成分的研究进展；轻工科技，2012 年 6 月第 6 期（总第 163 期）
【6】齐相薇，张湘宁，黄培春；海洋生物活性药物对细胞周期与凋亡的调控在抗肿瘤治疗中的作用；中国医药生物技术， 2012 年 4 月第 7 卷第 2 期
【7】张锦雯,王广基,孙建国,王玮,许美娟, 王睿,吕天；HPLC-荧光检测法测定大鼠血浆中大黄酸的浓度及其药代动力学；中国天然药物，2005年 7 月 第3 卷 第 4 期
【8】张典瑞,任天池,娄红祥，邢洁；HPLC测定冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠肝脏中的药物浓度；中国药学杂志，2 005年4月 第 4 0 卷第 8 期
【9】张典瑞,任天池,娄红祥，邢洁；冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠体内的组织分布及兔体内的药代动力学；药学学报，2005, 40(6):573- 576
【10】李捷，缪珊，王四旺，王剑波，谢艳华；HPLC 法测定大鼠血浆中色胺酮的浓度及药代动力学参数；中国药理学通报2012 Feb;28(2):270 ～4
【11】路通 ,宋珏 ,谢林 ,王广基 ,刘晓东；HPLC法同时测定灌胃黄芩水煎剂后大鼠血浆中黄芩苷和汉黄芩苷的质量浓度及药动学研究；中草药，第 36卷第 6期 2005年 6月
【12】蒋星军，任彩萍；分子成像及其应用；生命科学，2005年10月第17卷第5期
【13】朱新建，宋小磊，汪待发，白净；荧光分子成像技术概述及研究进展；中国医疗器械杂志，2008年32卷第1期
【14】曹璐颖，李克，郑文杰；甲醇沉淀法去除人血清高丰度蛋白质的实验研究；学研究生学报 2012 年 11 月 第 25 卷 第 11 期
【15】郭立安 ,阎哲 ,张晓楠 ,武丽华；三氯乙酸对蛋白质结构稳定性的影响；第四军医大学学报2001; 22( 22)
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
实验预期
抗肿瘤活性物质CPU-111经小鼠肝癌移植瘤模型初筛可知，可明显缩小肿瘤体积，与阳性药环磷酰胺相比具有更好的抗肿瘤效果。所以在前期进行了药理和药效学的研究基础上，对已明确具有抗肿瘤活性药物CPU-111进行初步研究该活性物质在动物体内的组织分布情况，并建立和优化体内分析方法。
研究内容
往届已经对通过细胞水平的药物进行筛选，得到了101、103、111、112 四个活性较好的化合物。发现化合物普遍对肝癌细胞株具有更好的活性，且对正常肝细胞的作用明显弱于对肝癌细胞株的作用。而在其中通过构建小鼠肝癌移植瘤模型，发现111 号化合物能够明显抑制肿瘤的生长，并且小鼠体重未见明显下降。已经通过光学显微镜等观察手段初步确立了111 号化合物能够通过线粒体通路诱导凋亡，具有良好的药理活性。随后建立了RP-HPLC测定大鼠血浆中CPU-111的方法，测定了其在SD大鼠中尾静脉给药后的血药浓度-时间曲线，并得到了其主要药代动力学参数，得到初步的结论：CPU-111在大鼠体内过程符合二室模型，分布比较快速，代谢较为缓慢。之后通过分子成像仪研究给药后各组织中活性物质的浓度，其中CPU-111含量最高的组织为肝， 脑、肺和骨骼肌次之，肠、胃含量变化相近。
接下来的研究主要侧重在研究CPU111的给药方法和其在组织中的不同寻常的分布。CPU-111脂溶性极好，在水中溶解不好，传统给药方式会使其剂量较小。但其在DMA中溶解度极佳，可以从适宜的有机溶剂入手提高溶解度，方便给药并且在液相中提高灵敏度。 CPU-111不同于普通药物在脑中分布较高，原因可能不仅是脂溶性好，更有可能是与体内某种物质结合，使其易透过血脑屏障。作为该化合物的特殊性质，需要我们深入研究。这是两个接下来的工作重点。
未来的工作计划我目前是这样规划的：
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