人NOTCH1 真核表达质粒的构建及生物学功能分析文献综述

 2022-12-28 10:47:00

开题报告内容：

研究目的：

通过提取细胞内cDNA分段扩增目的片段，overlap-PCR，同源重组技术，质粒转化及鉴定等方法构建pcmv-GFP-Notch1质粒来作为未来的研究的基础。

文献综述：

质粒（plasmid）是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，它们调节从海胆到人等多种生物细胞的发育。Notch信号影响细胞正常形态发生的多个过程，包括多能祖细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖及细胞边界的形成。Notch基因位点突变引起的表型改变，表明Notch信号作用的多样性。Notch 信号通路作为调控细胞增殖与分化的经典途径，
在众多癌症尤其是上皮细胞癌中起到重要的作用。Notch l 受体作为 Notch 信号通路的重要组成，在众多癌症中异常表达。在 Notch 信号通路中， Notch 受体通过与配体的相互作用转导细胞信号，进而在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要的调控作用。Notch 分子由胞外段、跨膜区和胞内段组成， 胞外段负责和配体的结合， 胞内段则含有多个功能结构域，是Notch 分子的主要功能区域。当胞外段受到配体刺激后，Notch 分子水解后在胞内释放 NIC 并进入核内与细胞因子ＲBP － J 相互作用，进而调节细胞的增殖、分化和凋亡 。哺乳动物有 4 种 Notch 受体: Notch1 － 4; 其中 Notch1与肿瘤，特别是上 皮 肿 瘤 的 的 关 系 最 为 密 切，因此我们选择将Notch1的NIC插入到表达载体中进行研究。

基本内容：

3.1基因克隆：

从 GenBank 中检索到 Notch1 的编码序列，根据其胞内段设计扩增引物 F1 ( 5 ＇ － CTGCTGTCCCGCAAGCGC － 3＇) 和 Ｒ1( 5＇－ CTTGAAGGCCTCCGGAATGCGG －3＇) 以及质粒构建引物 F2( 5＇－ CGGAATTCTGATGCTGCTGTCCCGC － 3＇，5＇端增加 EcoＲ I 酶切位点) 和 Ｒ2( 5＇－ CGGGATC-CTTGAAGGCCTCCGG － 3 ＇， 3 ＇端 增 加 BamH I 酶 切 位 点) 。CNE1 细胞培养 3 代以后， 利用 ＲNeasy Mini Kit 提取 ＲNA，PrimeScript ＲT － PCＲ Kit 反转录为 cDNA; 以该 cDNA 为模板，F1 和 Ｒ1 为引物进行 PCＲ 扩增， 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。T载体为线状的DNA片段，3rsquo;端带有突出的“T”尾，同时Tap酶在PCR 产物的5rsquo;末端加上非模板依赖性A碱基。TA克隆技术利用T碱基与A碱基互补配对，快速准确的使PCR产物在连接酶的作用下与T载体粘性连接，重组为环状DNA分子，从而极大提高克隆效率。

3.2质粒构建 ：

通过双点突变PCR扩增的方式分别获得1000kb和6000kb的片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。凝胶DNA提取PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切取DNA片段，放于1.5 mL离心管中称量后，加入3倍体积Buffer QG。50 ℃水浴10 min，检查其颜色为黄色后加入 1 倍体积异丙醇混匀并移入 2 mL吸附柱内。17 900 r/min离心1 min，弃收集液。 加500 mu;L

Buffer QG于吸附柱内，17 900 r/min离心1 min，弃收集液。加750 mu;L Buffer PE于吸附柱内，17 900 r/min离心1 min，弃收集液。将吸附柱放入新的1.5 ml收集管内，加50 mu;L Buffer EB，放置1 min，17 900 r/min离心1 min，弃吸附柱。收集的液体即为提取的DNA

溶液。提取 DNA 溶液通过光密度分析仪测定其浓度及OD值。回收产物与经限制性内切酶 EcoＲ I 和 BamH I 修饰后纯化，经 T4 DNA Ligase 连接后转化大肠杆菌。

3.3重组质粒的鉴定：

挑取单克隆，过夜培养后提取质粒; 质粒经 PCＲ 和单双酶切鉴定; 对阳性质粒进一步进行DNA 测序鉴定。

预期结果：

成功构建pcmv-GFP-Notch1质粒。寻找疾病诊断和治疗的新靶向奠定基础。为未来的实验以及研究做好准备。

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